Поддерживается ли еще гипотеза о преимплантационном генетическом скрининге (ПГС)? Обзор

Гипотеза о преимплантационной генетической диагностике (ПГС) была впервые предложена 20 лет назад, предполагая, что устранение анеуплоидных эмбрионов перед переносом улучшит частоту имплантации оставшихся эмбрионов во время экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), увеличит частоту беременностей и живорождений и уменьшит выкидыши. Вышеупомянутый улучшенный результат был основан на 5 основных предположениях: (i) Большинство циклов ЭКО терпят неудачу из-за анеуплоидных эмбрионов. (ii) Их устранение до переноса эмбрионов улучшит результаты ЭКО. (iii) Одна биопсия трофэктодермы (TEB) на стадии бластоцисты является репрезентативной для всей TE. (iv) TE плоидность достоверно представляет внутреннюю клеточную массу (ICM). (v) Плоидность не изменяется (т.е. самокорректируется) после стадии бластоцисты.Мы стремимся предложить обзор вышеупомянутых предположений и оспорить общую гипотезу PGS. Мы просмотрели 455 публикаций, которые по состоянию на 20 января 2017 г. были перечислены в PubMed по поисковой фразе . Обзор литературы был выполнен обоими авторами, которые согласовали окончательные 55 ссылок. Различные отчеты за последние 18 месяцев подняли важные вопросы не только об основной клинической полезности PGS, но и о биологических основах гипотезы, технической способности биопсии одиночной трофэктодермы (TE) точно оценить плоидность эмбриона и предположили, что PGS на самом деле отрицательно влияет на результаты ЭКО, но не влияет на количество выкидышей. Кроме того, из-за высокого уровня ложноположительных диагнозов вследствие высокого уровня мозаицизма у ТЕ,PGS приводит к выбрасыванию большого количества нормальных эмбрионов с потенциалом нормальных эуплоидных беременностей, если их переносить, а не утилизировать. Мы обнаружили, что все 5 базовых предположений, лежащих в основе гипотезы PGS, не подтверждаются: (i) Связь анеуплоидии эмбриона с неудачей ЭКО должна быть переоценена с учетом того, насколько распространен мозаицизм TE, чем считалось до недавнего времени. (ii) Надежное уничтожение предполагаемых анеуплоидных эмбрионов до переноса эмбрионов представляется нереальным. (iii) Математические модели демонстрируют, что один TEB не может предоставить надежную информацию обо всем TE. (iv) TE не отражает достоверно ICM. (v) Эмбрионы, вероятно, все еще обладают сильной врожденной способностью к самокоррекции ниже по течению от стадии бластоцисты, причем ICM делает это лучше, чем TE. Гипотеза PGS, следовательно,больше не кажется поддерживаемым. Поскольку все 5 основных предположений, лежащих в основе гипотезы PGS, были продемонстрированы как ошибочные, сама гипотеза PGS оказывается дискредитированной. Следовательно, в будущем клиническое использование PGS с целью улучшения результатов ЭКО должно ограничиваться научными исследованиями.

Задний план

Плодовитость женщин постепенно снижается с возрастом, что сопровождается значительным увеличением частоты анеуплоидий и самопроизвольных выкидышей [1]. Эти наблюдения привели к привлекательной логической гипотезе преимплантационного генетического скрининга (ПГС), согласно которой перенос только эуплоидных эмбрионов должен улучшить результаты ЭКО, при этом женщины старшего возраста считаются лучшими кандидатами. Однако PGS, впервые предложенная Верлинским и Кулиевым в 1996 г. [2], до сих пор остается недоказанной гипотезой, основанной на пяти предположениях: (i) Большинство циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) терпят неудачу из-за анеуплоидных эмбрионов. (ii) Их устранение до переноса эмбрионов, следовательно, улучшит результаты ЭКО. (iii) Одна биопсия трофэктодермы (TEB) на стадии бластоцисты является репрезентативной для всей TE. (iv) TE плоидность достоверно представляет внутреннюю клеточную массу (ICM).(v) Плоидность не изменяется (т.е. самокорректируется) после стадии бластоцисты.

Ввиду растущих сомнений в отношении общей гипотезы PGS, мы предлагаем обзор этих предположений, демонстрирующий, что ни одно из них на самом деле не выдерживает критики. Гипотезу PGS, таким образом, становится все труднее поддерживать.

Методы

Мы выполнили этот обзор на основе первичного литературного поиска 455 публикаций, которые по состоянию на 20 января 2017 г. были перечислены в PubMed под поисковой фразой . Ссылки на эти рукописи были дополнительно рассмотрены, если они были сочтены имеющими отношение к предмету. Обзор литературы был выполнен обоими авторами, которые согласовали окончательные 55 ссылок.

Обсуждение

История PGS

Пионеры PGS Верлинский и Кулиев опубликовали первый отчет в 1996 г. [2]. Таким образом, гипотеза только что отметила свое 20-летие, но пока не выполнила своего обещания по улучшению результатов ЭКО и снижению частоты выкидышей [3–11]. Тем не менее, PGS, тем не менее, процветала, достигнув значительного использования в циклах ЭКО [12]. Верлинский и Кулиев первоначально предложили ПГС путем биопсии полярных тел [13], но, поскольку это было технически проще, практика быстро перешла к более инвазивной биопсии эмбриона на стадии дробления (день-3) [14].

Этот метод PGS, в дальнейшем описываемый как PGS 1.0, приобрел широкую популярность, даже несмотря на то, что ряд клинических испытаний в Бельгии не смогли продемонстрировать положительный результат [15–17]. Только после того, как Mastenbroek et al опубликовали в 2007 году свое «печально известное» клиническое исследование [18], профессиональные организации признали бесполезность PGS 1.0 [19–21]. Они, однако, упустили из виду, что исследование Mastenbroek не только продемонстрировало отсутствие эффективности в улучшении результатов ЭКО, но, на самом деле, у пожилых женщин (т.е. у пациенток с плохим прогнозом) было продемонстрировано вредное воздействие в виде более низкой частоты беременностей. Вред у пожилых женщин также был подтвержден повторным анализом ранее отмеченных бельгийских исследований [3]. Более того, на основании того, что сторонники PGS объявили исследование Mastenbroek et al «серьезно ошибочным» [22], лаборатории PGS продолжили продвигать PGS 1.0,и врачи продолжали рекомендовать эту процедуру пациентам. Парадоксально, но клиническое использование PGS 1.0 продолжалось без требований доказательства эффективности.

Однако даже сторонники PGS понимали, что процедура PGS требует улучшений.

Поскольку основная гипотеза PGS все еще не оспаривалась, основное внимание уделялось техническим аспектам процедуры. Широко предполагалось, что более совершенные методы и технологии приведут к окончательной валидации PGS путем демонстрации ожидаемых улучшений результатов [22]. То, что основная гипотеза PGS может быть ошибочной, и что эффективность PGS может варьироваться в разных популяциях пациентов, было широко отвергнуто. Отрицание последнего, несмотря на исследование Мастенбрука [18], действительно было примечательно, поскольку пожилые женщины по-прежнему считались лучшими кандидатами на ПГС [23].

Появление новых диагностических технологий с явно улучшенной точностью хромосомных оценок открыло широкие возможности для технических усовершенствований. Они не только были более точными, чем PGS 1.0, но также позволяли исследовать полные хромосомные комплементы вместо ограниченных хромосомных панелей. Путем переноса биопсии эмбриона из одинарной (или двойной) биопсии бластомера на стадии расщепления (день-3) на биопсию трофэктодермы (TE) (TEB) на стадии бластоцисты (дни 5/6), впервые предложенных в 1990 году [24], больше генетических материалов можно было бы получить, предположительно сделав PGS (в дальнейшем называемый PGS 2.0) еще более точным [25]. В результате использование PGS 1.0 снизилось и было быстро заменено PGS 2.0, пропустив предварительное обязательное тестирование точности, точности PGS 2.0 и того, влияет ли на него мозаицизм TE [22, 26–28].

Клинические результаты PGS 2.0

Таким образом, PGS 2.0, использующий различные платформы сравнительного хромосомного скрининга для выявления эмбриональных анеуплоидий, был почти исключительно основан на предположительно более точной диагностике эмбриональных анеуплоидий. Несколько исследований заявили об улучшении клинических исходов ЭКО после PGS 2.0, что недавно было обобщено в метаанализе [29]. Из 29 статей, соответствующих критериям отбора, только три проспективных и восемь наблюдательных исследований соответствовали даже минимальным критериям включения. Авторы пришли к выводу, что только у пациенток с нормальным овариальным резервом (т.е. у пациенток с хорошим прогнозом) PGS 2.0 значительно улучшил клинические показатели и частоту стойкой беременности. Следует отметить, что пожилые пациенты с плохим прогнозом в первую очередь считались лучшими кандидатами на ПГС, а не женщины с хорошим прогнозом!

Эти выводы еще более ошибочны, поскольку у пациенток с хорошим прогнозом все методы отбора эмбрионов дополнительно улучшают результаты ЭКО у пациенток, которые даже без отбора эмбрионов достигают отличных исходов беременности. Следовательно, они меньше всего нуждаются в улучшении результатов среди пациентов с ЭКО. Однако методы отбора эмбрионов обычно не приносят пользы пациентам со средним прогнозом и совершенно вредны для пациентов с плохим прогнозом [30, 31], как ранее также отмечалось в связи с PGS 1.0 [18].

Эти результаты исследования также должны быть подвергнуты сомнению по статистическим соображениям, поскольку исследования в метаанализе, которые отдавали предпочтение PGS 2.0, были предвзятыми, поскольку они единообразно сообщали только об исходах ЭКО после переноса эмбрионов в первых новых циклах ЭКО. Однако релевантным параметром исхода должен быть общий репродуктивный потенциал каждого инициированногоцикла ЭКО. Следовательно, анализы должны включать перенос свежих и последующих замороженных / размороженных переносчиков с началом цикла контрольной точки (т. Е. С целью лечения), а не, как во всех включенных исследованиях, с переносом эмбриона контрольной точки, поскольку анализы с переносом эмбриона контрольной точки исключают плохой прогноз у пациентов, не достигших перевода [30].

Это недавно хорошо продемонстрировали Канг и др., Сообщая о влиянии PGS 2.0 на ЭКО старше возраста [32]. При переносе контрольных эмбрионов они обнаружили значительное улучшение показателей клинической беременности и рождаемости. Однако с началом цикла контрольной точки результаты заметно различались [33]: как уже было продемонстрировано Mastenbroek et al с PGS 1.0 [18], здесь авторы сообщили о значительно более низких показателях клинической беременности и живорождений (21,5% и 19,9%) в по сравнению с пациентами без PGS (49,5% и 39,8%). Сходные результаты были также получены Kushnir et al после повторного анализа национальных данных об исходах ПГС в США, которые изначально были ошибочно сообщены для демонстрации преимуществ результатов ПГС [34]. То, что ни одно исследование PGS 2.0 в литературе, заявляющее об улучшении результатов ЭКО, не основывалось на анализе результатов с началом цикла контрольной точки, следовательно,рассказывать.

Из-за отсутствия должным образом проведенных проспективных клинических испытаний, недавно была опубликована теоретическая модель для PGS 2.0, основанная на научно обоснованных данных в литературе о частоте бластуляции и анеуплоидии, частоте мозаицизма, технических ошибках и частоте имплантации / живорождения PGS и других случаев. Циклы PGS на стадии дробления и бластоцисты. Модель четко продемонстрировала превосходство циклов без PGS над циклами PGS по совокупной частоте живорождений (диапазоны 18,2–50,0% против 7,6–12,6%) [35].

Точность и прецизионность PGS 2.0

Начиная с 2015 года, клиническая применимость PGS 2.0 стала предметом все более пристального внимания. Помимо упомянутого выше скорректированного повторного анализа опубликованных исследований, в литературе начали сообщать о случаях, когда пациенты пережили самопроизвольные выкидыши после ПГС, которые после хромосомной переоценки оказались анеуплоидными, что повысило вероятность ложноотрицательных ТЭБ [36]. В то же время опасения по поводу ложноположительных TEB возникали у пациентов с относительно хорошим прогнозом, которые неоднократно подвергались циклам ЭКО, не достигнув переноса эмбрионов, поскольку все эмбрионы были зарегистрированы как анеуплоидные. Подозрение на то, что такие пациенты могут отбрасывать ложноположительные эмбрионы, ошибочно обозначенные как анеуплоидные, привело нас [32, 37] и других [38] к переносу таких эмбрионов, что привело к удивительно высокому нормальному уровню живорождения и, пока, к отсутствию выкидышей.

Тем не менее, частота TE мозаицизма у человеческих эмбрионов остается спорной, сообщается о 70 и 90% у эмбрионов на стадии дробления и бластоцисты, соответственно [39], но все чаще считается нормальным физиологическим феноменом [40]. Митотические, а не мейотические ошибки, по-видимому, составляют большинство [41]. Хотя Лю и др. сообщили, что 69% аномальных бластоцист у женщин пожилого возраста представляют собой мозаику для ICM и TE [42], Johnson et al. продемонстрировали, что у более молодых женщин 20% бластоцист являются анеуплоидными, при этом большинство аномальных бластоцист имеют только одну или две структурные хромосомные аномалии [43], что указывает на все еще критический уровень мозаицизма на стадии бластоцисты у молодых женщин [39].

В этих исследованиях был поставлен под сомнение один из основных аргументов в пользу перехода с PGS 1.0 на PGS 2.0 - снижение количества ложноотрицательных и ложноположительных биопсий эмбриона за счет более низкого риска мозаицизма с TEBs [22]. На самом деле, дело обстоит наоборот: подобно раковым клеткам, бластомеры ранних стадий человеческих эмбрионов демонстрируют повышенную экспрессию продуктов генов, участвующих в прогрессировании клеточного цикла, при отсутствии экспрессии генов контрольных точек клеточного цикла. Это потенциально увеличивает количество митотических ошибок, вызывая генетическую нестабильность. Стресс от расширенной культуры эмбрионов до стадии бластоцисты может, таким образом, способствовать увеличению мозаицизма [44].

Дополнительные доказательства неточного диагноза из-за мозаицизма TE были получены из исследований нескольких биопсий TEB, демонстрирующих до 50% расхождения между биопсиями одного и того же эмбриона в одних и тех же лабораториях и примерно до 80% расхождения между несколькими биопсиями в разных лабораториях [32 , 37, 45]. В недавно опубликованном исследовании оценивалось соответствие восьми эмбрионов множественным TEB и четырех эмбрионам соответствие биопсий TE и ICM. Противоречивые результаты (например, мозаицизм) наблюдались у 3/8 эмбриона [46].

Таким образом, мозаицизм TE может присутствовать по крайней мере в половине всех эмбрионов. Кроме того, лабораторные платформы, используемые для оценки TEB, могут предлагать различную диагностическую чувствительность и специфичность при обнаружении хромосомных аномальных клеточных линий, что дополнительно обсуждается ниже в обзоре недавно выпущенных практических рекомендаций для PGS 2.0 Международного общества преимплантационной генетической диагностики (PGDIS)[47]. .

Можем ли мы улучшить точность и точность PGS 2.0?

Вышеупомянутые наблюдения неудивительны, поскольку и TE, и ICM являются продуктами разных клеточных линий [48], причем ICM дает начало плоду, а TE становится плацентой. Даже у нормального эуплоидного потомства плацента часто засевается островками анеуплоидных клеток [49]. Таким образом, само по себе это наблюдение должно было привести к осторожности в отношении интерпретации TEB.

В поддержку большего мозаицизма в TE, чем в ICM, также являются недавние данные на мышах, которые продемонстрировали более эффективную самокоррекцию, которая устраняет клоны анеуплоидных клеток в ICM, чем в TE. То же исследование на мышах также продемонстрировало значительную самокоррекцию даже значительной степени анеуплоидии в ICM ниже по течению от стадии бластоцисты, что привело к 100% хромосомно нормальным пабам, причем до половины клеток ICM были анеуплоидными на стадии бластоцисты. Даже с двумя третями анеуплоидных клеток ICM, значительное меньшинство пабов было хромосомно нормальным при рождении [40]. Если аномальные эмбрионы на стадии бластоцисты все еще обладают способностью к самокоррекции ниже по течению, предполагая аналогичные способности у эмбрионов мыши и человека, любое рациональное объяснение TEB стадии бластоцисты исчезает.

Тогда возник вопрос, может ли один TEB надежно определить плоидность всего TE? Математические модели, предполагающие TEB с 6 ячейками (среднее зарегистрированное количество ячеек TEB) и ок. ТЕ всего 300 клеток [50], продемонстрировал, что вероятность ложноотрицательных и ложноположительных диагнозов слишком высока, чтобы определить, можно ли перенести эмбрион или его следует выбросить [51]. Исследование действительно показало, что TEB должен содержать не менее 27 ячеек для достижения математической вероятности точности. Следовательно, большее количество ячеек в TEB может повысить точность PGS 2.0. Однако недавнее исследование Нила и др. [52] опровергло это предположение.Эти авторы ясно продемонстрировали, что самый низкий уровень живорождения после переноса одного эмбриона был связан с TEB с самым высоким относительным содержанием ДНК (большое количество клеток), вероятно, в результате механического воздействия биопсии.

Несмотря на множество очевидных причин сомневаться в полезности PGS 2.0 в клинической практике, сторонники PGS по-прежнему выступают за непрерывное клиническое использование PGS [53]. Поэтому важно подчеркнуть, что бремя проверки клинической эффективности PGS лежит на сторонниках этой процедуры. Кроме того, эффективность клинических вмешательств не должна определяться не меньшей эффективностью, как предполагали некоторые сторонники PGS 2.0 [54], а статистически превосходными результатами. При отсутствии лучших клинических результатов дополнительные затраты и риски, связанные с процедурой, подобной PGS, не кажутся оправданными.

Последнее опубликованное мнение о «обнаружении мозаицизма в биопсиях трофэктодермы» указывает на то, что даже PGS 2.0 все еще демонстрирует значительные технические недостатки [53], но, опять же, предлагает только в основном технические объяснения, почему ни PGS 1.0, ни PGS 2.0 никогда не могли надежно определить являются ли эмбрионы хромосомно нормальными или нет (то есть могут быть перенесены или нет).

Рекомендации профессиональных обществ

Несмотря на такой упор на процедурные и технические аспекты PGS, примечательно, что ни одно из профессиональных сообществ, таких как Американское общество репродуктивной медицины (ASRM)или Европейское общество репродукции человека и эмбриологии (ESHRE),не прокомментировало ни то, ни другое. Нет и национальных властей, таких как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в США или Управление по оплодотворению и эмбриологии человека (HFEA) в Великобритании, хотя последнее в недавней передаче BBC объявило о возможном пересмотре в течение 2017 года.

Единственным обществом, которое прокомментировало использование PGS 2.0 после описанных выше недавних разработок и признания того факта, что мозаицизм TE на стадии бластоцисты значительно более распространен, чем предполагалось ранее, было PGDIS, которое недавно выпустило радикально пересмотренное новое руководство о том, как PGS 2.0 должны быть выполнены, должны быть выпущены лабораторные отчеты и как клиницисты должны интерпретировать эти отчеты [50]. Здесь они перепечатаны в таблицах 1, 2 и 3.

В этих рекомендациях Общество признало, что технические возможности PGS 1.0 и PGS 2.0 были недостаточными, и, следовательно, установило новые рекомендации по использованию диагностических платформ, определили новые диагностические определения для эмбрионов и значительно расширили, какие эмбрионы потенциально могут быть перенесены. Таким образом, он косвенно признал, что большое количество, вероятно, нормальных мозаичных эмбрионов было ошибочно выброшено в прошлом.

Поскольку до недавнего времени лаборатории PGS рекомендовали выбрасывать любой эмбрион при наличии любой наблюдаемой анеуплоидии, радикальный характер этих пересмотренных рекомендаций невозможно переоценить. Поэтому мы рассмотрим их более подробно.

В рекомендациях лабораториям PGS (Таблица 1) PGDISсообщил, что, поскольку только секвенирование следующего поколения (NGS) способно измерять количество копий хромосом, NGS должна быть единственной диагностической платформой, используемой для оценки мозаицизма TE в сочетании с PGS 2.0. Общество, однако, также признало, что даже NGS способна обнаружить мозаицизм только выше 20% порога. Таким образом, T изменил определение «нормальных (эуплоидных)» эмбрионов на мозаицизм TE ниже 20% (Таблица 1). Таким образом, даже «нормальные» эмбрионы могут содержать до 20% ТЕ-мозаики.

Поскольку большинство опубликованных показателей мозаицизма TE в литературе были основаны на платформах, отличных от NGS, и, поскольку даже NGS не обнаруживает весьмозаицизм TE, PGDIS, таким образом, прямо признал, что до сих пор в литературе значительно недооценивался истинный уровень мозаицизма TE.

Мозаика 20-80% TE биопсии в соответствии с этими новыми рекомендациями PGDISопределяется как «эуплоидно-анеуплоидная мозаика» (Таблица 1) и потенциально может передаваться (Таблица 2). Только биопсии с мозаичностью более 80% теперь считаются действительно «анеуплоидными» (таблица 1) и от них следует отказаться.

Учитывая, что до недавнего времени эмбрионы даже с самой незначительной степенью анеуплоидии считались «анеуплоидными» и, следовательно, от них отказывались, эти новые диагностические критерии являются поистине революционными. Однако они, к сожалению, снова полностью произвольны и лишены какой-либо доказательной поддержки. В литературе нет данных, подтверждающих новые пороговые значения PGDIS,которые определяют описанные выше новые диагностические критерии для эмбрионов. Таким образом, они по-прежнему не позволяют надежно определить, следует ли перенести биопсированные эмбрионы или выбросить их.

В некоторой степени это подтверждается PGDIS в своих рекомендациях для врачей (таблица 2), которые впервые предлагают возможность переноса эмбрионов с мозаичными TEB до 80%, а в таблице 3 действительно предлагается иерархия для таких переводы.

Эти рекомендации, однако, на данный момент являются спекулятивными. Некоторые рекомендации даже противоречат здравому смыслу, например, рекомендация, что в первую очередь, если все эмбрионы в цикле ЭКО представляют собой «эуплоидно-анеуплоидную мозаику», должен быть «следующий цикл ЭКО с тестированием на анеуплоидию, чтобы увеличить шанс выявления нормальных эуплоидных клеток». бластоцисты для переноса ».Почему при таких обстоятельствах пациенту с переносимыми эмбрионами «эуплоидно-анеуплоидная мозаика» следует пройти дополнительное лечение и столкнуться с дополнительными расходами на новый цикл ЭКО, кажется неясным.

Однако самым примечательным в этих пересмотренных рекомендациях является полное отсутствие каких-либо дискуссий о клинической полезности PGS 2.0. Принимая во внимание все описанные здесь недостатки PGS 2.0, неявно признанные PGDISв этих новых рекомендациях, возникает вопрос, почему все же следует применять PGS 2.0?

Выводы

Мы начали этот обзор с утверждения, что, исходя из пяти предположений, PGS остается недоказанной гипотезой. Здесь мы продемонстрировали, что все пять из этих предположений действительно неверны: (i) давно существующая ассоциация анеуплоидии эмбриона с неудачей ЭКО должна быть переоценена, а опубликованные статистические ассоциации должны быть пересмотрены с учетом того, насколько распространен мозаицизм TE. . (ii) Надежное уничтожение предполагаемых анеуплоидных эмбрионов до переноса эмбрионов представляется нереальным. (iii) Математические модели демонстрируют, что один TEB не может предоставить надежную информацию о хромосомной составляющей всего TE, а биопсии большего размера снижают потенциал имплантации бластоцист. (iv) TE, как участок каждой биопсии эмбриона в PGS 2.0, не отражает достоверно ICM. И (v) эмбрионы, с большой вероятностью,все еще обладают сильными врожденными способностями к самокоррекции ниже по течению от стадии бластоцисты, причем ICM делает это лучше, чем TE.

Принимая во внимание, что мы, кроме того, также продемонстрировали, что ни одно должным образом проанализированное исследование не смогло продемонстрировать преимущества клинических исходов для PGS 2.0, и, действительно, все больше данных свидетельствует о том, что PGS 2.0, по крайней мере, в неблагоприятных популяциях пациентов, которые считались лучшими кандидатами для PGS 2.0 может фактически снизить шансы на беременность и живорождение, поэтому трудно понять, почему PGS 2.0 все еще следует проводить в сочетании с ЭКО. Единственное возможное оправдание использования PGS 2.0, основанное на текущих знаниях, по нашему мнению, это пациенты с хорошим прогнозом с большим количеством эмбрионов высокого качества, у которых ранее не было нескольких переносов эмбрионов.